pediatru.MyForum.ro :: Genetica si mai buna intelegere a unor boli hematologice la

Trimis: 14/06/2010 08:19

Genetica si mai buna intelegere a unor boli hematologice la copil

Articol din publicatia Medicina Moderna

Prof. dr. Mircea Geormaneanu, U.M.F. "Carol Davila", Bucuresti.

Pentru ilustrarea titlului acestor insemnari ma voi referi la sindroamele talasemice, abordand unele complicații clinice, de fiziopatologie, patogenie si tratament.

Clinic, exista forme severe, forme silentioase si înfățișări usoare de betatalasemie.

Forma severa majora a fost descrisa pentru întâia oara, asa cum este bine cunoscut, in anul 1925, de catre Thomas Cooley, care a dat si numele acestei boli. Initial, multi copii afectati mureau de insuficienta cardiaca anemica, in jurul varstei de 2 ani.

In urmatoarele 4 decenii, a fost initiat tratamentul cu eritrocite transfuzate, dar modalitatea neregulata de utilizare se solda exclusiv cu corectarea temporara a anemiei severe, cu amendarea – de asemenea temporara - a unora dintre consecintele acesteia (slabiciune si oboseala, de exemplu). Dar, bolnavii prezentau concomitent si alte manifestari importante: insuficienta cardiaca, cardiomegalie, hepato- si splenomegalie, cu marirea consecutiva a abdomenului, oprirea cresterii cu retard in dezvoltare si maturare. Expansiunea „neinduratoare dar zadarnica” a maduvei osoase, era mai putin eficienta in corectarea anemiei, dar se soldata cu subtierea si fracturarea oaselor lungi si vertebrelor, precum si cu distorsionarea caracteristica a oaselor fetei si craniului (facies mongoloid, craniu turiform). In plus, hiperactivitatea acelor locatii ale maduvei osoase, redevenita hematogena la o varsta cand nu ar mai fi trebuit sa aiba acest atribut, se asocia cu absorbtia crescuta a fierului, prin tractul gastrointestinal, si incarcarea consecutiva cu fier a unor organe si structuri (inclusiv pielea, care devine „maslinie”), cunoscuta ca hemocromatoza. Manifestarile fenotipice evocatoare (in rarisim clinice) apar la varsta de 6-12 luni, din motive pe care le vom detalia imediat.

Fiziopatologic si patogenic, amprenta tuturor formele de betatalasemie (inclusiv betatalasemia majora sau boala Cooley) este sinteza nebalansata a lanturilor de globina din componenta Hb (fie a lanturilor alfa, fie a lanturilor beta), sinteza de care sunt responsabile gene specifice.

Genele pentru lanturile beta se afla pe cromozomul 11. In talasemii, exista o mare diversitate mutationala. Majoritatea acestor mutatii abolesc complet expresia genelor respective. Sn betatalasemie (ca si in celelalte forme de talasemie, de altfel), se folosesc simbolurile beta0, pentru formele in care mutatiile abolesc perfect sinteza, si beta+, in formele in care este determinata numai scaderea cantitativa, cu 5-30%, a exprimarii genei.

In formele cumplit de severe (betatalasemia majora, betatalasemia beta0 la homozigoti, cu genotip beta0/beta0 sau boala Cooley), sinteza latului beta al globinei fiind absenta, lanturile alfa sunt in exces relativ, producandu-se distrugerea unui numar mare de eritrocite si anemie severa consecutiva. In plus, in scop de inlocuire, este sintetizata majoritar HbF, care moduleaza gravitatea bolii, intarziind, prin efect protector, aparitia manifestarilor fenotipice evocatoare, pana la varsta de 6-12 luni.

Inainte de nastere, fetii betatalasemici homozigoti se dezvolta normal. Se produce - asa cum deja am mentionat - hemoglobina „alternativa” HbF, in care globina are doua lanturi alfa si doua lanturi gamma. Abia catre sfarsitul vietii fetale, in al treilea semestru de viata intrauterina, scade producerea de gamma-globina si creste compensator producerea de beta-globina, rezultand sinteza de hemoglobina adulta alfa 2/beta 2. La betatalasemici, gena beta-globinei nu poate comuta in totalitate aceasta trecere si nou-nascutul va fi teribil de anemic

In mod normal, structura Hb se schimba de 2 ori in cursul vietii prenatale. Mai intai, se face tranzitia de la Hb embrionara la Hb fetala. Apoi, la nastere, se transforma pentru a 2-a oara structura Hb, „trecandu-se” de la Hb fetala la Hb adulta.

Hb embrionara este compusa din 2 lanturi de globina zeta si 2 lanturi de globina epsilon. Hb fetala este prezenta in sange in ultimele 2 trimestre de viata intrauterina si este compusa din 2 lanturi globinice alfa si 2 lanturi globinice gamma. In aceasta perioada, Hb fetala este predominanta.

HbF are afinitate crescuta pentru oxigen, marind abilitatea fatului (partial hipoxic) sa foloseasca o cantitate suficienta de oxigen provenit de la mama pe cale transplacentara,.

La nastere, pentru comutarea despre care am vorbit, genele care controleaza sinteza de lanturi globinice alfa, devin operationale. Rezulta astfel Hb adulta, compusa din 2 lanturi alfa si 2 lanturi beta. Gruparea genica (cluster-ul) pentru alfa-globina se afla pe cromozomul 16, iar cea beta pe cromozomul 11 Deletii sau mutatii in aceste „clustere” genice afecteaza abilitatea genei de a realizează lanturile globinice necesare pentru asamblarea Hb adulte functionale, afectand in grade variate (de la minimal, la marcat) mecanismul de comutare si generand configurații mai usoare sau mai severe de talasemie.

Anemia Cooley, cea mai severa forma de betatalasemie, survine atunci cand cele două gene beta-globinice au suferit mutatii, bolnavul fiind homozigot. Mutatia este obisnuit punctuala (mutatie „de punct”). Este substituit un solitar nucleotid din secventa ADN. Alti bolnavi mostenesc in totalitalitate cromozomul in care lipseste gena beta-globinica. In ambele eventualitati, rezultatul este o anemie severa, care necesita aplicarea un program transfuzional regulat, agreat in anemia Cooley

Daca este implicata numai una din cele doua gene beta-globinice, copiii afectati sunt fie „purtatori silentiosi”, asimptomatici si cu eritrocite normale, fie (cei mai multi) sunt numai „purtatori” ai mutatiilor, prezentand numai un grad mic de anemie si microcitoza.

Biologia moleculara moderna a identificat mai mult de 200 de mutatii, care pot sa apara la indivizii cu betatalasemie. Mutatiile specifice afecteaza fiecare treapta a afluxului informatiei genetice, corelata cu producerea lanturilor globinice. Studierea acestor mutatii a furnizat informatii asupra secventelor nucleotidice, necesare expresiei genei beta-talasemice, pe fiecare treapta de exprimare. Mutatia specifica poate fi corelata cu severitatea bolii, astfel ca anumite mutatii „de punct” reduc moderat transcriptia genei beta-talasemice. Purtatorii acestui tip de mutatie dezvolta talasemia beta+ in care – terapeutic - nu este trebuință de stabilirea si efectuarea unui program transfuzional regulat si continuu. In schimb, homozigotii pentru mutatia care sisteaza prematur sinteza proteica au eritrocite lipsite complet de beta-globina si dezvolta beta0-talasemia, in care anemia este severa (anemie Cooley), iar programul transfuzional se impune.

Exista insa bolnavi cu anemie Cooley, care sunt purtatorii unei alte mutatii, suferite de gena care controleaza sinteza lantului alfa-globinic, facand ca boala sa fie mai usoara (urmare a diminuarii imbalantei lanturilor globinice si a micsorarii formarii agregatelor de lanturi alfa-globinice insolubile). Molecular, devine astfel evidenta probabilitatea ca „modificari” genetice sa interactioneze cu mutatiile care determina boala si sa influenteze severitatea expresiei fenotipice a acestei boli.

A fost identificata o „stare” numita „persistenta ereditara a HbF” (HPFH), in care exista niveluri crescute ale HbF in sange, in procent de 20-100, fata de pana la 1, cat are postnatal un individ normal (ca urmare a comutarii la nastere a Hb fetale in Hb adulta). Mutatiile din HPFH, linkate cu genele alfa-globinice sau plasate pe un alt cromozom decat in betatalasemia majora au, de asemenea, posibilitatea de a actiona ca modificatori genetici, putand afecta postnatal nivelul Hb fetale si permitand o mai buna intelegere a patogeniei anemiei Cooley. Mostenirea concomitenta a acestor mutatii la indivizii cu boala Cooley poate diminuează gravitatea bolii.

Intregul „cluster” genic al beta-globinei, incluzand gena gamma fetala si gena beta adulta, este influentat de un segment de ADN, numit LCR (locus-ul de control pentru regiune). LCR controleaza activarea regiunii de pe cromozomul 11 care contine cluster-ul de gene beta si permite expresia genelor globinice specifice, in diferite stadii de dezvoltare, precum si influentarea nivelului de formă a acestora.

Referitor la tratament, mentionez mai intai ca a fost subliniat in lucrari recente ca „supravietuirea bolnavilor cu anemie Cooley a fost imbunatatita dramatic” prin completarea (sau inlocuirea) terapiei transfuzionale de sange si chelarea fierului, cu transplantul de maduva osoasa sau cu terapia genica moderna. Iata cu au evoluat optiunile terapeutice.

Dupa 4 decenii de la descrierea bolii si initierea tratamentului transfuzional neregulat cu eritrocite (prima optiune terapeutica) s-a trecut la cea de a doua optiune: transfuzarea regulata, continua si de lunga durata (toata viata) de eritrocite. Prin aceasta conduita viata bolnavilor s-a imbunatatit considerabil.

Acest program transfuzional regulat, continuu si de lunga durata, inceput din copilarie, a reusit sa diminueze gradul de anemie severa si sa previna (sau diminueze) expansiunea extrema a maduvei osoase, cu distorsiune osoasa consecutiva. Acest proces - asociat cu efectele bolii insasi (distrugerea excesiva de eritrocite) - este urmat de hemocromatozaa si hepatosplenomegalie de mărimi monstruoase.

Succesele terapiei transfuzionale regulate, continue si de lunga durata s-au datorat nu numai acestui program, ci si progreselor realizate in tehnica transfuziilor de sange. Au putut fi astfel evitate reactiile posttransfuzionale, prin genotiparea eritrocitelor inainte de prima transfuzie si prin utilizarea eritrocitelor congelate in glicerol, spalate si filtrate. Prin aceste metode, a fost minimalizat riscul transmiterii infectiilor prin transfuzii. S-a stabilit totodata ca este optima efectuarea transfuziilor la intervale de 2-4 saptamani. Programele transfuzionale au permis bolnavilor sa traiasca o viata aproximativ normala, incluzand cresterea si dezvoltarea. A fost redusa, de asemenea, si absorbtia gastrointestinala a fierului, dar o acumulare chiar minima, dar continua de fier a conceput alte 2 probleme terapeutice: splenectomia si – in excepțional – chelarea fierului inmagazinat.

A treia optiune terapeutica este – din aceasta cauza - splenectomia, Riscul infectiilor dupa splenectomie trebuia insa inlaturat prin imunizarea bolnavului, inainte de interventia chirurgicala, cu vaccin pneumococic multivalent si cu vaccin anti-Haemopholus influenzae tip B, cum ar fi si prin profilaxia postoperatorie cu penicilina (la aceasta din urma metoda nu s-a renuntat nici in prezent, desi sepsis- ul postsplenectomie practic a disparut).

A patra optiune terapeutica a fost chelarea fierului cu deferoxamina. Prin programul transfuzional, este evitata chiar si partial – asa cum am aratat – absorbtia gastrointestinala de fier, provenit din distrugerea eritrocitelor, distrugere provocata de boala insasi. Prin programul trensfuzional, efectuat un timp indelungat, se folosesc insa cantitati mari de sange (pana la varsta de 12 ani un bolnav poate primi echivalentul a mai mult de 150 unitati de eritrocite, care contin, ca parte integranta a Hb transportoare de oxigen, o cantitate apreciabila de fier, pe care organismul nu-l poate excreta). Organismul are insa – pana la un anumit nivel – puterea de a inmagazina, fara riscuri, surplusul de fier. Atunci cand este depasita cantitativ aceasta capacitate de inmagazinare de fier, fara riscuri, excesul devine daunator pentru tesuturile si organele care il depoziteaza (in special, ficat, splina, miocard, pancreas, diferite organe endocrine, in special hipofiza anterioara). Fierul devine toxic si dezvolta boli hepatice, diabet zaharat, miocardita sau alte afectiuni si este adesea responsabil de moartea prematură (prin implicarea inimii). Devine astfel obligatorie chelarea fierului si promovarea consecutiva a excretiei lui. Din anul 1962, a fost folosita, in acest scop, deferoxamina (Desferal), dar - administrat pe cale orala – acest medicament este foarte putin absorbit, fiind necesara administrarea injectabila, pe o durata extraordinar de lunga. Deferoxamina este insa si extrem de rapid eliminata, ceea ce face necesara - in scopul realizarii efectului dorit - perfuzia zilnica, prelungita (9-12 ore zilnic), pe cale subcutanata sau intravenoasa. Administrarea se face la domiciliu, obisnuit s.c. Se folosesc pompe portabile, administrandu-se cantitati de deferoxamina capabile sa cheleze eficace fierul inmagazinat. „Trialuri” clinice au atestat eficienta metodei. De folos este urmarirea (monitorizarea) pe termen lung a testelor functionale ale principalelor organe in care este inmagazinat fierul (ficat, inima, pancreas, hipofiza anterioara). O buna monitorizare s-a putut realiza prin analiza chimica a fierului in tesutul hepatic obtinut bioptic. Au fost realizate si masuratori neinvazive, magnetice, ale susceptibilitatii hepatice, folosind metoda SQUID (superconducting quaritum interference), prin care sunt furnizate date echivalente din punct de vedere cantitativ. Dozarea serum-feritinei este, de asemenea, folosita pentru estimarea incarcarii cu fier a organismului, dar aceasta metoda este numai un ghid general asupra severitatii bolii. Printr-un remediu eficient de chelare, s-a concretizat scaderea opresiunii asupra intregului organism, descresterea cantitatii de fier stocat in ficat, ameliorarea functiilor inimii, pancreasului si mai multor alte organe, ameliorarea cresterii, maturarii carnale si fertilitatii (inclusiv, posibilitatea procrearii unor copii normali) si marirea sperantei de viata. Prin „trialuri” clinice prospective s-a demonstrat ca, daca bolnavul poate primi cantitatea de deferoxamina de care are nevoie, speranta de viata poate „atinge” in 90% din cazuri 25 de ani. In schimb, cei care nu pot sau nu vor sa primeasca cantitatea necesara pentru o chelare eficienta, procentul de supravietuire se reduce, iar riscul complicatiilor creste semnificativ. Magnitudinea opresiunii asupra intregului organism a devenit un criteriu de stabilire a punctului critic la care apar complicatiile tezaurizarii fierului.

Administrarea deferoxaminei prezinta insa si unele dificultati, si anume: incapacitatea unor bolnavi de a primi cantitati suficiente de medicament, in deosebit in ultima parte a copilariei si la adolescenta; impactul negativ asupra parintilor, ca urmare a plasarii permanente si pe perioade lungi, sub epidermă – mai ales in cursul noptii - a unui ac (cu impact negativ asupra calitatii vietii); unele reactii adverse, care tin mai mult de superdoza de cat de medicament si sunt destul de rare (reactii alergice, sau reactii induse de toxicitatea medicamentului, aceasta din urma manifestandu-se prin tulburari de vedere si auz sau prin anomalii ale cresterii si structurarii oaselor in copilarie); necesitatea administrarii in perfuzie s.c. sau i.v. timp de 8-12 ore pe zi; iritatia pielii; riscul unor infectii bacteriene, mai ales daca perfuzia se face i.v. In sfarsit, terapia cu deferoxamina pe termen deosebit de lung este scumpa, evaluandu-se un cost care ar putea atinge sau depasi 10 000 dolari pe an.

A cincea optiune terapeutica este chelarea fierului cu agenti potential eficienti in administrare orala. Devenise astfel necesara identificarea unui agent chelator de fier - succesor al deferoxaminei – eficient, mai putin costisitor si la fel de activ, dar administrat pe cale orala. Dintre cei examinati numai unul (descoperit in anul 1982) – Deferiprone (1,2 dimetil-3-hidroxipiridin-4-one) sau L1,CP20 sau DMHP) - a fost gasit apt pentru experimentare („trial”) clinic(a). S-a gasit ca acest agent chelator de fier induce scaderea sustinuta a fierului inmagazinat, dar produce neutropenie severa sau agranulocitiza, fapt care i-a limitat semnificativ folosirea (a stimulat, insa, continuarea cercetarilor asupra unor alti agenti orali de chelare a fierului, fara astfel de urmări adverse).

Continuand seria optiunilor terapeutice in anemia Cooley, despre care am vorbit cu precadere si pana acum, ma voi referi in final si la ultimele doua optiuni terapeutice: transplantul de maduva osoasa si terapia genica.

Transplantul de maduva osoasa reprezinta in prezent o moderna (si agreata) metoda terapeutica curativa in anemia Cooley. Mai multe cauze restrang insa aplicarea pe scara larga a acestei metode: 1) morbiditatea si posibila mortalitate generata de transplant; 2) disponibilitatea limitata a donatorilor de maduva osoasa; 3) dificultatile de gasire a unor posesori de celule stem compatibile.

Este principalul motiv pentru care, progresele medicinii moleculare au putut anticipa ca terapia genica de inlocuire – ultima optiune terapeutica la care am intentia sa ma refer - are mari perspective de a ajunge principala optiune terapeutica in diverse hemoglobinopatii, inclusiv in anemia Cooley. Dupa ce a fost identificat defectul genic cauzal, este „inserata” in celula-tinta corespunzatoare o gena normala, care va prelua toate functiile genei afectate. Anomaliile genice, ca si celulele „tinta” din anemia Cooley sunt astazi cunoscute, iar celulele hematopoietice stem sunt accesibile in maduva osoasa. Practic, dupa distrugerea medicamentoasa a maduvei osoase a bolnavului, aceasta este inlocuita cu maduva osoasa sanatoasa de la o ruda genetic compatibila. Aceasta maduva „de import” va sintetiza o Hb normala si va face din boala Cooley o boala curabila.

Succesul terapiei genice de inlocuire este asigurat de abilitatea de a insera o „gena terapeutica” in celulele stem si a obtine un nivel inalt de reglare a expresiei genice la progenii acestor celule multipotente. Va fi asigurata astfel baza terapiei curative la majoritate bolnavilor la care nu se poate face transplantul de maduva osoasa.

Defectul primar din boala Cooley fiind descresterea productiei de lanturi de beta-globina, aceasta boala va deveni un fel de prototip pentru terapia genica de inlocuire.

Sunt cunoscute, in prezent, elementele de reglare necesare pentru obtinerea unui nivel inalt de exprimare a genei globinei. Trebuie insa dovedita posibilitatea realizarii in eritrocite a unei expresii suficiente a genei normale, pentru a fi corectata functional deficienta care determina talasemia (mentionez insa ca nu este necesara corectarea in totalitate a deficientei de sinteza a beta-globinei, intrucat este dovedit ca talasemicii heterozigotii, la care sinteza beta-globinei este redusa cu numai 50%, pot fi asimptomatici).

Exista dificultati de punere in practica a terapiei genice. Astfel, celulele hematopoietice stem, fiind celule primitive de auto-innoire, sufera un proces de diferentiere, din care rezulta eritrocitele necesare, dar si alte celule ale sangelui circulant (din seriile mieloida si limfoida. In acest mod, este necesar un mare numar de celule stem, obtinut prin imbogatire si purificare, care sa asigure - prin diferentiere - un numar suficient de celule din seria eritroida, care vor fi folosite ca celule tinta in terapia de inlocuire genica. In al doilea rand este nevoie ca prin cultivarea stimulata in vitro sa nu fie compromisa abilitatea celulelor de a se auto-reinnoi, de a se mentine multipotente si a se diferentia, putand sa-si mentina valoarea de a exprima gena terapeutica pe termen lung. In acest sens, devine necesara suprimarea tendintei celulelor cultivate de a se diferentia, pierzandu-si multipotenta .

Terapia genica se bazeaza in prezent pe folosirea (in scopul transferarii genei terapeutice in celulele tinta) a unui vector (un retrovirus modificat). Retrovirusul întrebuințat uzual este virusul leucemiei murine alterat structural (astfel incat sa fie asigurata incapacitatea replicarii lui si, deci, incapacitatea de a produce boala, ca de pildă si de a purta numai gena „de interes”, celulele producand secventele de ADN ale vectorului retroviral). Aceasta inginerie genetica îngăduie celulelor astfel pregatite sa insereze gena terapeutica in celula-tinta. Proteinele necesare pentru formarea particulelor virale sunt codificate intr-un genom helper. Obisnuit, vectoii retrovirali pot insera gene numai pe celulele in diviziune activa. Cum la om multe celule stem sunt pasive, adica nu se divid, intrarea acestora in ciclul activ se face cu ajutorul citokinelor. Vectorii retrovirali patrund in celula cu ajutorul proteinelor transmembranare, care actioneaza ca receptori.

Sunt cautati in prezent si alti vectori virali inofensivi (de exemplu, virusul adeno-asociat sau AAV nu cauzează boli la om si se integreaza intr-o pozitie specifica pe cromozomul 19 uman). Sunt explorate si ale virusuri-vectori (lentivirusurile, de exemplu), dar reglajul genic pare sa fie mult mai complex.

Este posibila si creșterea unor sisteme de vectori, care sa nu se bazeze pe virusuri: folosirea lipozomilor sintetici (proteine sintetice „imbracate” in grasime), in asociere cu o proteina bacteriana care faciliteaza insertia in cromozom a genei normale, in locul celei afectate.

O alternativa la inlocuirea genei „cu defect” sau la corectarea genei in talasemie este folosirea unui element transcriptional, pentru a reactiva genele gamma-globinei „tacute” (pasive), care „au schimbat directia” comutarii de la Hb fetala la Hb adulta.

Au fost identificati multi dintre reglatorii transcriptionali, implicati in determinarea cresterii nivelului expresiei genei globinei, ca de exemplu si proteine reglatoare, care determina balanta sintezelor gamma- si beta-globinelor. Folosirea unui reglator transcriptional, care sa activeze gena gamma, poate induce o productie de Hb fetala suficienta pentru corectarea deficientei functionale a sintezei beta-globinei. Pe de alta parte, diminuarea expresiei unei proteine, care activeaza genele beta-globinei in timpul vietii postnatale poate reactiva sinteza Hb fetale, prin eliberarea locus-ului elementelor de control, pentru a interactiona cu promotorul genei gamma-globinei.

In concluzie, se poate considera ca – desi rezultatele unora dintre cercetari nu au inca aplicabilitate clinica sau au inca probleme nerezolvate (activarea celulelor stem pasive, gasirea de noi vectori, clarificarea mecanismelor reglatoare etc.) - perspectivele unei terapii genice eficiente in anemia Cooley par sa fie bune.

Nota. Aceste insemnari nu sunt originale. Ele au fost culese relativ recent (anul 2003) dintr-o biblioteca din New Jersey, au fost selectate si au fost puse intr-o anumita ordine de semnatarul acestor randuri, cu gandul ca ar putea fi de folos cititorilor.